细胞实验-细胞实验外包公司-南京英瀚斯生物科技
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南京英瀚斯生物科技有限公司

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Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名:2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】,是一种类似于MTT的化合物,它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯(1-Methoxy PMS)存在的情况下,被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活xi胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。









 细胞ELISPOT检测    

     1.培养板的预处理:在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛,37℃,4h,弃掉板中的处理液,用PBS洗涤3次,每次3min;

     2.抗原包被:将适量抗原溶于包被缓冲液中,每孔加入0.5ml,4℃过夜,PBS-T洗涤3次,每次3min;

     3.制备细胞悬液:将待测已致敏小鼠处死,取出pi脏,置于加有Hanks液的平皿内,用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后,赶出细胞,用毛细吸管轻轻吹散细胞团后,将悬液通过250目尼龙网,取滤液,1000r/min离心5min,Hanks液洗涤3次,计数细胞后,用1640液重新悬浮细胞,配成所需浓度;

     4.往各孔中加入0.5ml含不同浓度(104-106/ml)的细胞悬液,置37℃,5%CO2条件下孵育2-4h,弃掉培养液,PBS-T洗涤3次,每次3min;

     5.往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti(Bio-Ab)(2μg/ml),37℃孵育1h或4℃过夜,弃掉液体,PBS-T洗涤3次,每次3min;

     6.加入辣根过氧化物酶结合的亲合素(Avi-HRP)(2μg/ml),37℃孵育30min,弃掉液体,PBS-T洗涤3次,每次3min;

     7.配制明胶-底物液:在37℃水浴中,将2.5mlTMB溶液(4mg/ml  jia醇溶液)滴加入7.5ml10%明胶溶液(用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制)边加边搅,溶液呈白色,加入14μl 3% H202;

     8.显色与计数:将培养板底冰浴,每孔加入0.6ml明胶-底物液,约3min,混合液凝固,将培养板取出,置室温5min,将板倒置,用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。




细胞培养中常见的污染及解决方法


支原体污染

支原体是隐蔽的污染物,不能通过过滤去除。显微镜下没有任何可见的支原体污染迹象,比如细胞病变和浊度或 pH 值变化(即使在严重污染的培养基中),这样就会导致我们产生错误的安全感。而在牛中,支原体是常见的微生物之一。

解决方法:通常的过滤灭菌方法对支原体没有影响。细胞一旦被支原体污染,特别是对重要的细胞系,必须去除支原体,一般的方法有、抗和抗与补体联合。值得注意的是,支原体很突出的结构特征是没有细胞壁。因此,它对作用于细胞壁的生物合成(如 β-内酰胺类、万古等)完全不敏感,并且通常对多粘菌素、利福平和类具有耐药性。相反,四环素类和大环内酯类对支原体的抑制作用很强,而氨基糖苷类和氯的抑制作用较弱。





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