英瀚斯(图)-细胞实验外包公司-细胞实验
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细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡

流式细胞术检测细胞周期:

细胞周期:指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期:有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上无法与G1期区分,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。S期:DNA开始合成,细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期:当DNA成为4倍体时,细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。

一般流程:细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。

细胞凋亡:细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前,检测PS的表达,能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS有很高的亲和性,并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理,可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差,因而只能标记坏死的细胞。

一般流程:细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。

结果示例:





                                   图 A 细胞周期检测图;B 细胞凋亡检测图







小鼠精原gan细胞分离富集和培养

成年小鼠gao丸中约有108个细胞,其中约有 2×104个是精原gan细胞,仅占gao丸生精上皮细胞总数的 0.02~0.03%,精原gan细胞数量太少不利于体外培养.分离和富集精原gan细胞成为精原gan细胞体外培养能否成功的前提条件.寻找分离和富集小鼠精原gan细胞有效方法. 方法:出生6-8天小鼠为实验对象,先用0.25%胰酶1mM EDTA消化gao丸10min,用胎牛xue清终止消化,用一次40-um孔径的滤器过虑制成单 细胞悬液,30%percoll不连续密度梯度法离心富集精原gan细胞,再根椐未分化精原gan细胞表面thy1.2(CD90.2)阳性CD117(c- kit)阴性特点用流式细胞仪将精原gan细胞分选出来,并在体外进行培养尝试. 结果:30%percoll密度梯度离心前CD117(c-kit)阳性细胞占13.80±3.34%,CD90.2阳性细胞占28.98±4.51%, 二者都阳性细胞占8.98±2.98%,CD117阴性CD90.2阳性细胞占18.36±2.67%;离心后 CD117(c-kit)阳性细胞占12.37±3.34%,CD90.2阳性细胞占56.98±4.51%,二者都阳性细胞占 8.20±3.98%,CD117阴性CD90.2阳性细胞占32.36±3.67%;CD117(c-kit)阳性细胞和二者都阳性细胞所占百分比前后 比较差异无显著性(P>0.1),CD90.2阳性细胞和CD117阴性和CD90.2阳性细胞所占百分比前后比较差异有显著性 (P<0.05);采用CD117和CD90.2作为标志分子,percoll离心后细胞悬液经FACS分选后获得细胞纯度



自噬流检测

自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的话化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病,特别是、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关,目前对于自噬液的检别是自噬与其相关疾病研究领域的热点。由于自噬流是一个曲多个步骤组成的动态过程。因此往需要精细的突验才能准确判断自啦流状态。





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