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分子实验介绍——荧光定量PCR检测

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的普遍的方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr green和taqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低，目前选用的较多。

SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程：细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例：

图 A 基因扩增曲线图；B 基因扩增溶解曲线图；C mRNA相对表达量变化

从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果，溶解曲线可以看出引物识别特异性情况，通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。

1、细胞准备：细胞传到后，密度达到70％左右时进行转染；

2、细胞转染:取两个EP管，一个加入Opti-MEM、质粒和包装质粒；另一个加入Opti-MEM、lipo2000，然后将两管混匀；

3、细胞孵育：将混合液逐滴加入细胞培养皿中，混匀后孵育；

4、收集病毒：转染后48h、72h收集含慢病毒的上清；

5、滴度检测:细胞为30%－50％时加入病毒上清液，检测阳性细胞比例。

RNA酶（Rnase）是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定，在一些的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。

1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套

2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。

3. 塑料制品、玻璃和金属物品的处理

（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。