细胞实验学平台
慢病毒载体构建
慢病毒载体构建

细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系

慢病毒包装:公司使用3质粒慢病毒包装系统,慢病毒系统使用pLKO.1-EGFPpsPAX2pMD2.G,过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFPpsPAX2pMD2.G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中,培养48h后,收集上清。使用genecopoeia公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度,其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
滴度检测:将病毒颗粒使用梯度稀释,分别感染293T细胞,感染72h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。

细胞感染:在病毒感染前一天对细胞进行计数,接种约10000个细胞于12孔板中,培养过夜后使用无血清培养基稀释病毒,加入12孔板中对细胞进行感染,病毒数量根据推荐细胞的感染MOI加入(若无推荐MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,100 5个梯度对细胞感染),感染6h后去除含病毒溶液,加入完全培养基细胞培养,培养48h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选,筛选约2周时间。细胞筛选好后,使用定量PCRWestern blot检测目的基因的稳定表达情况。
实验流程:慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞感染-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定


结果示例:

 

图 A 病毒滴度检测;B 目的细胞病毒感染效果图