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定量PCR检测
定量PCR检测

分子实验介绍——荧光定量PCR检测

荧光定量PCR是检测生物样品中RNA含量的最普遍的方法,通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。目前主要使用Sybr greentaqman法对RNA含量进行检测。Sybr green在低样本量时成本较低,目前选用的较多。
SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时,发出荧光;从DNA双链上释放出来时,荧光信号急剧减弱。因此,在一个体系内,其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是:1、开始反应,当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2DNA变性时,SYBR Green染料释放出来,荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后,SYBR Green染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

实验流程:细胞或组织RNA提取-RNA浓度检测-RNA逆转录-定量PCR检测。

结果示例:

 

图 A 基因扩增曲线图;B 基因扩增溶解曲线图;C mRNA相对表达量变化

 

从图中可以扩增曲线可以看出目的RNA扩增效果,溶解曲线可以看出引物识别特异性情况,通过使用ΔΔCt方法计算可以得到每个组中目的mRNA表达变化。