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手把手教你筛选与转录因子TF结合的共调控因子,为你的lncRNA研究思路锦上添花
信息来源:www.njyhsw.cn    发布时间:2021.01.06
以下文章来源于i生信 ,作者小坚果
近几年长链非编码RNA(lncRNA)作为国自然申请方向中的一个火热的研究热点,通过各种数据库,芯片,二代测序等等等,好不容易在自己研究的肿瘤里找到了一个心仪的lncRNA,验证了一系列的表型或功能。那么接下来机制研究怎么搞呢?或许大多数人研究的方向为其找下游,比如用ChIRP-seq实验寻找与lncRNA相互作用的DNA,或者用ChIRP-MS、体外转录RNA pulldown方法去寻找与lncRNA作用紧密的转录因子蛋白等等。其实如题,既然你的lncRNA功能这么强大,我们还可以找上游,找到调控它的TFco-factors下面就根据几种不同的预测数据及实验验证思路对我们的文章锦上添花。
1、首先,准备数据库。需要用到几个数据库,如NCBIUCSC找启动子;PROMO找预测TFThe human protein atlas找蛋白定位;基于TCGA数据库的GEPIA找目的基因生存分析及表达相关性。
2、得到基因的promotor序列:拿驱动蛋白KTN1 DNA为例。首先,我们在UCSC genomebrowser中输入KTN1,
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点击你看的顺眼的那条KTN1的转录本(具体怎样选转录本在Uniprot上查找“canonical)”,可以看到KTN1的概述,点击GenomicSequence,
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只在Promoter/Upstream位置打勾,注意Downstream不要打勾,我就吃过亏,它指的不是转录起始位点TSS的下游,而是全基因的下游!!
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点击submit,返回得到KTN1的启动子序列。
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3、找预测转录因子:接下来,打开PROMO数据库,http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3,首先选择左侧SelectFactors,我们选择human,点击SearchSites,把刚才查找的KTN1启动子序列复制进去,错误率设置为0,点击submit。
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可以看到,KTN1 promotor的转录因子预测有18个。分别点击进去,可以了解预测的结合位点等等信息。下面就可以进行验证了,用IDT网站或者Primer 6.0软件等进行这18个基因的引物设计,在你收取的肿瘤组织中分别做验证,是否正调控(一般转录因子都是positive的),砍掉几个没用的,留下有用的,再分别设计siRNA在细胞系中进行敲低,留下对KTN1影响明显的那个。OK,TF选择搞定。
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4ChIP实验验证是否结合:上面假设我们后选择了XBP-1这个TF,可以看到,XBP-1与KTN1的预测结合位点在AGTCAT,那么ChIP实验被应用,设计包含AGTCAT序列的KTN1引物,买个ChIP kit检测,很漂亮,确实有变化。之后就是通过luciferase或者EMSA套路的方法检验二者是否在这个结合位点结合,验证完毕。
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5、与TF相互作用的共调控因子的筛选:
继续以XBP-1为例。首先,我们用XBP-1抗体做一个CO-IP实验,SDS-PAGE电泳后考马斯亮蓝染色或者银染,银染敏感性更高一些。切胶送去打质谱。一般切胶回收的质谱都只能定性不能定量。从质谱的结果中减掉IgG背景值后筛选Fold change大于2.0以上的差异蛋白。
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下面我们来筛选可能作用的co-factor,首先在GEPIA数据库中输入已经筛出来的差异蛋白名称,检测与XBP-1的相关性,以FOXP1为例,选择Correlation输入Gene A为XBP-1,Gene B为FOXP1,选择你研究的肿瘤,点击Plot,看,相关性数据出来了。一般我们选取R值大于30%相关系数的蛋白。
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接下来,打开The human protein altas数据库,搜索FOXP1及其他CO-IP出来的蛋白,可以发现FOXP1主要定位于细胞核内,so,结合与XBP-1的相关性分析,排除掉单纯位于细胞质内或细胞膜的蛋白,细胞核内的蛋白作用可能性大。
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6、后,CO-IP-WB验证:按上述方法筛选出小范围的几个蛋白进行WB验证,正确位置即显示条带。后,附上此co-factor肽段图谱,加入到lncRNA机制研究中,完美5分以上文章。